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2022年12月10日-13日，第64届美国血液学年会（ASH）在美国路易斯安那州新奥尔良市以“线上+线下”的形式隆重召开。四川大学华西医院血液团队聚焦血液肿瘤治疗新探索，其最新临床、转化、基础研究成果被遴选为2022ASH大会壁报交流。现CCMTV·血液频道将其研究整理为“临床研究篇”、“预测模型篇”、“临床前研究篇”，邀请各研究第一作者及权威专家进行解读与点评。
本“临床前研究篇”特邀请第一作者王梦瑶博士、赵艾琳博士、徐菁博士、杨沛沛硕士进行研究解读，同时邀请贾永前教授、向兵教授、龚玉萍教授、张丽教授进行点评。

摘要号：4796


两种新型甲氨蝶呤胶束的制备及其抗淋巴瘤作用的研究


第一作者解读·王梦瑶博士
在Burkitt淋巴瘤等高度侵袭性非霍奇金淋巴瘤（NHL）治疗中需要整合到大剂量甲氨蝶呤（HD-MTX）。但MTX存在原料药物水溶性差、靶组织药物浓度低、毒副反应大、继发耐药等问题。聚合物纳米胶束在水中自组装形成疏水内核与亲水外壳的载体而负载疏水性抗肿瘤药物，其粒径在纳米级别，在肿瘤部位因高通透性和滞留效应（EPR effect）而富集，达到被动靶向的效果。共载药物纳米递送系统可以将多种化疗药物作为一个整体共同传输。通过控制药物比例持续处于协同作用范围内而使疗效最大化，如CPX351（固定阿糖胞苷、柔红霉素摩尔比例为5:1的纳米脂质体）。因此，我们希望通过制备MTX胶束制剂以解决以上问题，并通过构建共载胶束系统进一步增强MTX抗淋巴瘤疗效。藤黄酸（GA）是一种从藤黄类植物中分离出的小分子广谱抗癌药物，通过诱导细胞周期阻滞、诱导凋亡、抑制细胞生长信号通路发挥抗肿瘤作用，在化疗与放疗增敏、逆转耐药方面也有重要作用，文献报道MTX与GA具有一定的协同作用。
首先，我们以本实验室工艺为基础，通过开环聚合法合成了多种生物安全性良好的高分子材料—乙二醇-聚酯共聚物。经筛选以单甲基聚乙二醇-聚己内酯（MPEG-PCL）为原料，运用薄膜水化法对MTX进行包载，对其理化参数进行表征，并对其体内外抗淋巴瘤疗效进行考察。MPEG-PCL-MTX纳米胶束具有粒径小（PS 25.96nm）、分散均匀（PDI 0.135±0.03）、包封率和载药量高的特点（DL 3.83%，EE 96.62%），其稳定性良好，较游离药物具有一定的体外缓释作用。MTT实验发现MPEG-PCL-MTX纳米胶束在高浓度时，对人淋巴瘤Raji细胞的抑制作用显著优于游离药物，并可诱导更多的Raji细胞凋亡。小鼠Burkitt淋巴瘤模型中，同等剂量条件下MPEG-PCL-MTX的抗淋巴瘤效果明显优于市售MTX注射液组，且低剂量（3mg/kg）的MPEG-PCL-MTX胶束可以实现与高剂量（7mg/kg）MTX注射液相当的抗淋巴瘤效果。
在此基础上，我们对MTX和GA进行共同包载，精细调节投料比，得到一系列载药质量比例不同的MTX/GA-MPEG-PCL纳米胶束。对其药学参数进行表征。MTT法检测不同质量比例MTX/GA-MPEG-PCL纳米胶束作用于淋巴瘤细胞后的细胞活力，通过计算药物联合作用指数，分析不同质量比例纳米胶束MTX与GA的相互作用，筛选协同效果最好的MTX/GA-MPEG-PCL纳米胶束进行后续研究。最后建立NOD/SCID小鼠 Burkitt淋巴瘤皮下肿瘤模型，监测肿瘤负荷以评估MTX/GA-MPEG-PCL纳米胶束体内抗淋巴瘤作用。通过优化工艺，我们得到了一系列不同质量比例的MTX/GA-MPEG-PCL纳米胶束，[MTX：GA （W/W）为1:10、1:5、1:1、5:1、10:1、50:1、100:1]。所得胶束具有粒径小（PS 20.36-30.14nm）、分布均匀（PDI 0.129-0.199）等特点，透射电镜摄片显示其微观形貌为近球形颗粒，包载量稳定，体外稳定性好。MTT结果显示MTX：GA （W/W）为1:1、5:1、10:1的共载纳米胶束具有较优的抗淋巴瘤协同作用，其CI50值分别为0.77、0.69和0.76。监测小鼠Burkitt淋巴瘤肿瘤负荷，相比于单载胶束（MTX-MPEG-PCL和GA-MPEG-PCL）、混合游离药物（MTX注射液+GA溶液），MTX/GA-MPEG-PCL的纳米胶束具有更明显的抗淋巴瘤作用。且相比于生理盐水组，共载胶束治疗组小鼠体重无明显变化，无明显系统毒性。
在此研究中，我们所构建的 MTX 纳米胶束具有以下几方面的优势：（1）以生物安全性良好的 MPEG-PCL为原料，制备过程相对简单，制备过程安全、绿色、高效，有望实现临床转化。（2）MPEG-PCL-MTX 纳米胶束对 Burkitt 淋巴瘤肿瘤杀伤作用强，低剂量MPEG-PCL-MTX纳米胶束可以实现与高剂量注射液相当的疗效，因而可以减低药物用量，
实现减轻毒副作用的目的。（3）MTX/GA-MPEG-PCL的纳米胶束中，亲水性更强的GA提高了共载胶束的体系稳定性， 使其能够较长时间以统一整体在体内循环、 进入肿瘤组织和细胞， 对药物进行共传输。（4）通过处方的细致优化和体外药效学的评价， 我们筛选出了抗淋巴瘤效果最优的共载胶束。体内实验证明，共载MTX/GA纳米胶束抗淋巴瘤效果确切。
 贾永前教授点评
化疗或免疫化疗是目前大多数NHL的可及的标准治疗方案。但部分亚型的NHL使用以蒽环类药物为主的方案进行化疗难以实现完全缓解，容易出现复发和耐药，需要进行强化化疗。由于淋系来源肿瘤对甲氨蝶呤（methotrexate，MTX）敏感性较高，MTX被用于多种淋巴瘤的联合化疗，并且在化疗方案中常需使用到大剂量MTX（high dose methotrexate，HD-MTX）。如在Burkitt淋巴瘤、淋巴母细胞淋巴瘤、侵袭性套细胞淋巴瘤等高度侵袭性淋巴瘤中，Hyper-CVAD/HD-MTX/Ara-C方案是首选化疗方案之一；SMILE方案（内含HD-MTX）为治疗进展期NK/T细胞淋巴瘤的首选方案之一。同时HD-MTX至今仍是治疗原发中枢神经系统淋巴瘤（primary central nervous system lymphoma，PCNSL）和淋巴瘤中枢转移最为有效的单药之一，也是多种联合化疗方案中的基石药物。
HD-MTX的定义是使用常规剂量10-20倍的剂量（>20mg/kg或500mg/m2至>40mg/kg或1000mg/m2）在4h至24h进行输注，使滴注结束时血清MTX峰浓度高于100µmol/l。其原理为当血液中MTX浓度达到较高水平后，血液与组织中MTX的浓度梯度顺差明显，MTX可以以被动扩散的方式渗透肿瘤组织和细胞。输注HD-MTX可以显著提高肿瘤组织和细胞内MTX的作用浓度。在透过血脑屏障等方面具有明显优势。但HD-MTX输注后会导致严重的血液学毒性和肝肾毒性、胃肠粘膜炎、重症感染等。严重的毒副作用增加了患者的痛苦和经济负担，同时，因不良反应导致计划外的药物减量、停用也会降低疗效，对预后产生不良影响。为避免HD-MTX的严重毒性，在使用时需要监测血药浓度，及时使用甲酰四氢叶酸钙（calcium folinate，CF）解救，并充分补液和碱化尿液促进MTX排泄。尽管HD-MTX在NHL的治疗中具有重要的作用，其严重的毒副作用给临床治疗上带来了巨大的风险和困难。
毒副作用明显是MTX在临床治疗中最重要的问题，但限制其临床应用的问题还包括：（1）原料药物难溶于水，通过调节PH值增溶的MTX注射液稳定性差。（2）临床上使用中，不少肿瘤细胞对MTX逐渐产生了耐药性，导致临床出现复发或者难治。MTX在临床中极为重要，研究者们设计合成了新一代叶酸拮抗药物普拉曲沙（pralatrexate，PDX）。对比MTX和其他的抗代谢药物，PDX与肿瘤细胞表面高表达的还原叶酸受体（reduced folate carrier，RFC）结合能力更强，因此可以被肿瘤细胞大量摄取。PDX在2009年被美国FDA批准用于外周T细胞淋巴瘤（peripheral T-cell lymphoma，PTCL）的治疗。但目前的多个临床试验结果均显示，PDX的不良反应较MTX常见且严重。由于作用机制上的差异，目前PDX的适应症仅仅局限于T细胞淋巴瘤的治疗，不适用于B细胞淋巴瘤。临床反馈的数据说明，PDX适应症相对MTX局限，不能取代MTX在NHL中的治疗地位，因此仍然需要设计开发结构上与MTX相似的新型化合物或新型制剂。

摘要号：1101


氟诺替尼，一种新型JAK2/FLT3抑制剂，可有效治疗噬血细胞性淋巴组织细胞增多症并增加对地塞米松的敏感性


第一作者解读·赵艾琳博士
研究背景：氟诺替尼是课题组陈俐娟教授及牛挺教授自主研发的新一代JAK2/FLT3双靶点抑制剂，全名马来酸氟诺替尼，简称FM，具有全新骨架，其活性、选择性、药效学、安全性均展现出极大优势。前期我们已经发现了FM治疗骨髓增殖性肿瘤的体内外药效均较好，目前也正在华西医院血液内科开展FM治疗骨髓增殖性肿瘤受试者的I期临床试验，安全性和初步疗效较好。
研究目的：受启发于噬血细胞性淋巴组织细胞增生症（HLH）未被满足的治疗需求、及其JAK/STAT通路过度激活的特点，本研究探索了FM治疗HLH的药效及机制，拟从细胞、动物模型、患者标本层次探索JAK2/FLT3双靶点抑制剂FM治疗HLH的药效，并与芦可替尼及菲卓替尼进行对比，进而探索FM联合地塞米松治疗HLH的药效及机制。
研究方法：本研究首先研究HLH中代表性激活的T细胞和巨噬细胞，进行体外药效学研究，其次建立原发性HLH小鼠模型、继发性HLH小鼠模型，进行体内药效学研究，再者探索FM与地塞米松联合治疗的药效及机制研究。
研究结果：体外研究发现，FM可以抑制T细胞、巨噬细胞的增殖，诱导G2/M细胞周期阻滞，诱导细胞凋亡，降低IL-6、TNF-a等细胞因子；体内研究发现，FM对继发性HLH小鼠可缩小肝脾，升高血红蛋白、血小板，降低铁蛋白，降低IL-6、TNF-a、IL1a、IL1β、IL2、IL3、IL9、IL10、IL12、IL13、IL17A、IFN-γ、MCP-1、GM-CSF、MIP-1a、MIP-1β等细胞因子，减轻肝脾炎症、“噬血”现象，以上效果都是优于芦可替尼或ED方案治疗，且FM联合地塞米松由于二者单用；此外，FM联合地塞米松治疗，可抑制脾脏JAK/STAT通路关键蛋白磷酸化，抑制外周血CD8+T细胞扩增等。
结论：FM治疗HLH的体内外药效均优于芦可替尼和地塞米松，本研究为HLH的治疗提供了新的治疗思路和手段。
 向兵教授点评
以往已上市的治疗血液肿瘤的JAK2/FLT3抑制剂，只有2种：菲卓替尼和帕瑞替尼，但都没有用于治疗HLH的报道。芦可替尼，作为JAK1/JAK2抑制剂，有部分基础实验和临床试验正在探索其治疗HLH的效果。氟诺替尼相比于已上市的3种JAK2抑制剂的优势在于，其对JAK2的选择性更高，安全性较好，并且前期在多个MPN小鼠模型、HLH小鼠模型的药效学、安全性数据均显示，FM缩小肝脾、降低细胞因子效果优于芦可替尼，HLH小鼠模型中，FM可提升血三系，而芦可替尼进一步降低血三系，加重HLH表现。在未来的治疗中，氟诺替尼有望与糖皮质激素联合治疗HLH。

摘要号：2598


KMT2D缺失通过调节核糖体的生物合成促进髓系白血病发生


第一作者解读·徐菁博士
背景：表观遗传异常是急性髓系白血病 (AML) 发生发展的重要机制。表观遗传基因KMT2D编码组蛋白H3K4甲基转移酶，是人类肿瘤中高频突变的基因之一。KMT2D在淋巴瘤及多种实体肿瘤中具有肿瘤抑制作用，然而其在AML发生发展中的生物学功能及分子机制尚不清楚。
目的：我们的研究拟明确KMT2D在AML发生发展中的作用及机制。
方法：首先，通过公共数据库分析KMT2D在AML患者中的突变及表达情况。然后，通过shRNA干扰技术及CRISPR/Cas9基因编辑技术构建KMT2D敲低或缺失的小鼠AML移植模型，以明确KMT2D在AML发生发展中的作用。其次，利用RNA-seq分析KMT2D表达变化对正常造血干/祖细胞及AML细胞的转录组影响，结合CUT&Tag分析KMT2D对下游通路及基因的调控，并进行生物学验证，以明确KMT2D在AML中的作用机制。最后，我们通过分析TCGA数据库中AML患者的转录组并在KMT2D突变的AML细胞系MOLM-13中验证相应表型，以明确人类AML是否通过类似的分子机制起作用。
结果：KMT2D 在AML患者中以错义或截断突变为主且普遍低表达，低表达与不良预后相关。移植了被靶向KMT2D的shRNA及sgRNA编辑的造血干/祖细胞的受体小鼠较对照组小鼠的生存期缩短，流式及病理等分析证实AML的发生。通过多组学分析发现KMT2D下调可能通过甲基化修饰影响mTOR通路负调控因子DDIT4的表达，激活mTOR信号通路，促进核糖体生物合成。通过实验证实了在KMT2D下调的AML细胞中DDIT4表达下调、mTOR信号通路活化、核糖体生物合成相关基因上调、核仁大小及新生蛋白含量增加等。AML患者及人源细胞系中同样发现了KMT2D与核糖体生物合成功能的相关性。靶向核糖体生物合成的抑制剂CX-5461能有效延缓KMT2D表达下调所致AML的发生。
结论：KMT2D是AML发生发展中的抑癌基因，其缺失可以促进AML的形成。KMT2D可以通过直接结合并调控DDIT4基因表达，抑制mTOR信号通路及核糖体生物合成功能，最终抑制AML的发生发展。靶向核糖体生物合成具有治疗KMT2D表达下调或突变AML的潜在价值。
 龚玉萍教授点评
徐菁医生的研究发现KMT2D是急性髓系白血病发生发展中肿瘤抑制基因，通过表观遗传修饰调控核糖体生物合成，从而影响肿瘤的发生。基于作用机制，研究团队发现一种新型的核糖体生物合成抑制剂CX-5461能降低Kmt2d低表达AML小鼠的肿瘤负荷，并有效延长小鼠的生存时间。CX-5461是针对核糖体生物合成的一种新型靶向制剂，通过抑制转录因子SL1结合于rDNA启动子区域，选择性抑制RNA聚合酶I驱动的rDNA转录，抑制rRNA合成。研究结果提示靶向核糖体生物合成具有治疗KMT2D低表达或突变AML患者的潜在临床价值。
由于研究团队发现KMT2D低表达是AML患者的不良预后因素，因此临床上可以根据KMT2D的表达水平对患者进行预后分层，并对这类预后不良的KMT2D低表达或突变AML患者亚群采用核糖体生物合成的靶向治疗。
该研究为表观遗传在AML发生发展中的作用及机制提供了新认识，为临床KMT2D突变或低表达AML患者的治疗提供了新思路，有待在临床病人样本中进一步验证。
同时，KMT2D的突变与异常在淋巴瘤和其他类型白血病中也很常见，如滤泡淋巴瘤KMT2D突变频率约为80%，弥漫大B细胞淋巴瘤中突变频率约为25%，急性T淋巴细胞白血病的突变频率约为28%。因此，在AML中观察到的现象和得出的结论有可能对淋巴瘤或其他类型白血病的研究与治疗也具有重要的借鉴价值，可以在具有该类分子遗传学异常的其他疾病中进行拓展研究。

摘要号：2668


负载SELINEXOR的聚合物胶束用于多发性骨髓瘤的治疗研究


第一作者解读·杨沛沛硕士
多发性骨髓瘤（multiple
myeloma, MM）是一种克隆性浆细胞异常增殖的恶性疾病，是血液系统第2位常见恶性肿瘤，多发于老年，目前仍无法治愈。随着蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂、CD38单克隆抗体等药物的出现，MM患者的总生存率在过去几十年有了显著的改善。然而，大部分MM患者会出现疾病复发或难治，MM疾病异质性特征导致每一次复发都会带来更差的预后。因此，仍需要探寻更多有效的治疗方案。塞利尼索（Selinexor, SEL）是第一款已上市的高选择性，可逆的XPO-1抑制剂。尽管塞利尼索联合地塞米松在复发难治MM患者中展现出了良好的治疗效果，但其单药疗效有限，且不良反应严重。尤其是恶心、呕吐、腹泻等胃肠道症状，严重影响了患者的生活质量。近年来，纳米药物在肿瘤治疗领域取得了极大的进展，鉴于纳米载药系统的特点和优势，研究者构建了塞利尼索胶束，以期达到增强治疗效果并减少不良反应的目的。
主要研究方法包括通过薄膜水化法包载SEL（mPEG-PCL-SEL），采用马尔文粒度仪测定胶束的平均粒径、电位和多分散性系数。通过透析法测定mPEG-PCL-SEL胶束的释放行为。检测mPEG-PCL-SEL对RPMI-8226细胞株和ARD细胞株的细胞毒性和凋亡诱导情况。将ARD-luc细胞通过尾静脉注射至6周龄B-NDG小鼠体内，建立原位MM模型。治疗分组为：4组分别静脉注射生理盐水、空白胶束、mPEG-PCL-SEL(SEL浓度分别为2.5、5mg/kg)，其余4组分别经口灌胃给予游离SEL (SEL浓度分别为2.5、5、10、15mg/kg)，每周给药2次，共治疗2周，并通过生物发光成像评估肿瘤负荷。通过测量小鼠体重、血常规和观察小鼠状况来进行毒副作用评价。
mPEG-PCL-SEL粒径为31.3nm，多分散性系数为0.11-0.16，zeta电位为-4.52
mV，包封率为90.56%。胶束在较长时间内能保持稳定，并具有一定的缓释性。此外，mPEG-PCL-SEL对MM细胞表现出剂量依赖的增殖抑制作用。最重要的是，在原位多发性骨髓瘤模型中，该胶束表现出了良好的治疗效果。肿瘤生物发光定量分析显示，5mg/kg mPEG-PCL-SEL治疗组的疗效优于10mg/kg 游离SEL治疗组，但差异无统计学意义。同时，相较于游离SEL治疗组，mPEG-PCL-SEL治疗有效延长了骨髓瘤小鼠的生存期。并且胶束治疗组未出现血常规异常及明显的体重下降，说明该胶束具有良好的安全性。
在本研究中，我们报道了通过薄膜水化法包载的mPEG-PCL-SEL对MM的治疗研究。据我们所知，目前尚无关于SEL递送的相关研究报道。mPEG-PCL-SEL与相同剂量水平的游离SEL相比具有更好的治疗效果，并表现出与大剂量游离SEL相似或更好的肿瘤抑制作用，并延长了小鼠生存期。同时，胶束制剂具有可接受的耐受性和安全性。值得注意的是，所有治疗组均未达到完全缓解，这可能是由于单药治疗的疗效有限。因此，今后的研究可以考虑SEL及其他药物的联合递送方案，以进一步提高对MM的治疗效果。
 张丽教授点评
伴随多发性骨髓瘤患者总生存率的显著改善，大部分骨髓瘤患者将会面临疾病复发或难治的难题，我们也会面临新药物、新技术的再选择。塞利尼索是第一款已上市的高选择性的、可逆的人类核输出蛋白XPO-1抑制剂，目前已被批准用于复发/难治多发性骨髓瘤患者的治疗。但该药单药治疗的疗效非常有限，不良反应严重，尤其是恶心、呕吐、腹泻等胃肠道反应，严重影响了患者的生活质量。
近年来，纳米药物在肿瘤治疗领域取得了极大的进展，包括脂质体聚合物胶束、仿生纳米粒等，可以通过物理装载或化学连接的方法负载药物、造影剂、核酸等进行体内传输，在疏水性抗肿瘤药物的输送方面具有较大的优势。在这项研究中，鉴于纳米载药系统的特点和优势，华西血液团队构建了SELINEXOR纳米胶束，在体外、体内有效性及安全性评估中呈现了良好的稳定性和缓释性。在原位多发性骨髓瘤模型中，通过静脉注射的给药方式，低剂量的SELINEXOR纳米治疗组在表现抗肿瘤疗效的同时，胃肠道不良反应显著减少，安全性良好。
这项研究旨在通过纳米体系的构建，探索优化抗多发性骨髓瘤用药的未来之路。以此研究为例，通过包括双药共载、仿生纳米粒的构建等，高靶向性纳米药物的研发也在同步进行中，以期进一步提高现有药物的递送效率，增强对多发性骨髓瘤的治疗效果，同时减少药物的毒副作用。

编辑：xu
审核：日斤、13
专家审阅：王梦瑶博士、贾永前教授、赵艾琳博士、向兵教授、徐菁博士、龚玉萍教授、杨沛沛硕士、张丽教授

专家简介
贾永前 教授
四川大学华西医院血液科教授/主任医师，医学博士，博士生导师
中国医疗保健国际交流促进会血液学分会常委
中国抗癌协会肿瘤血液病学专业委员会常委
中国康复血液病学专业委员会委员
四川省血液病专业委员会前任主任委员
成都医学会血液专科分会主任委员
四川省卫计委血液学领军人才


专家简介
向兵 教授
四川大学华西医院血液科副主任医师
成都市医学会血液专委会委员
中华医学会肿瘤专委会骨髓瘤学组委员
四川老年医学会血液专委会副主任委员
中国实验血液病专委会委员
承担四川省科技厅科技计划项目两项
专业主攻方向淋巴瘤和多发性骨髓瘤

专家简介
龚玉萍 教授
四川大学华西医院血液内科教授，博士生导师，血液科副主任
上海第二医科大学血液学博士
美国北卡州立大学/加州大学博士后
四川省学术和技术带头人
四川省卫生健康领军人才
成都市有突出贡献的优秀专家
中华医学会血液学分会血栓与止血学组成员
四川省医学会血液专委会副主任委员
四川省医学会血液专委会白血病学组组长
四川省女医师协会血液专委会副主任委员
四川省政协委员
民建四川大学委员会副主委、华西支部主委

专家简介
张丽 教授
四川大学华西医院血液内科，医学博士，医疗组长，副主任医师，副教授
本科生导师、硕士生导师、住院/专科规范化培训导师
2010年毕业于天津血液病研究所，2016年出国研修
中华医学会血液学分会第11届委员会浆细胞疾病学组委员
中国抗癌协会血液肿瘤专业委员会第2届青年委员会委员
中国抗癌协会第5届血液肿瘤专业委员会骨髓瘤与浆细胞疾病学组委员
亚洲骨髓瘤网AMN委员
四川省女医师协会委员
四川省女医师协会血液专业委员会青年委员会副主任委员
主持国家自然科学基金项目2项、主持中国抗癌协会横向课题1项
《中华血液学杂志》第10届编辑委员会通讯编委、《Precision Clinical Medicine》青年编委、《Blood》中文版青年编委
《Journal of Hematology & Oncology》、《中国循证医学杂志》、《中国医学科学院学报》、《华西医学》等审稿人


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